Lo scopo di un trapianto di midollo osseo è quello di sostituire le cellule del midollo osseo e del sangue di un paziente malato con quelle prelevate da una persona sana. L'obiettivo della terapia genica è quello di riparare le cellule malate di un paziente introducendo una versione normale del gene coinvolto nella malattia. Ci sono possibilità di riparare un gene nel vero senso della parola (specialmente la tecnica CRISPR/Cas9), ma non sono tecniche non ancora utilizzate in ambienti clinici.
Midollo osseo e cellule staminali ematopoietiche.
Il midollo osseo è un organo diffuso situato all'interno delle ossa. È una fabbrica in cui si producono miliardi di elementi cellulari del sangue, che qui nascono e si moltiplicano. Nel sangue circolano tre principali famiglie di cellule: globuli rossi responsabili del trasporto di ossigeno, globuli bianchi (polinucleaie, linfociti e monociti) responsabili della difesa dalle infezioni e piastrine responsabili della prevenzione del sanguinamento attivando la coagulazione.
Il midollo osseo rende questi elementi diversi da cellule speciali chiamate cellule staminali ematopoietiche. Queste cellule, definite indifferenziate, sono come una tela che può essere usata per fare ciò di cui il corpo ha bisogno. Queste cellule sono in grado di moltiplicarsi e differenziarsi in globuli rossi, globuli bianchi o piastrine. I globuli rossi e le piastrine hanno una emivita relativamente lunga (120 giorni per i globuli rossi e 10 giorni per le piastrine). Le cellule polinucleari e i monociti, invece, hanno un tempo di dimezzamento più breve e si rinnovano rapidamente. Se necessario, la riserva viene mobilitata e la produzione di cellule viene intensificata. Il midollo osseo è essenziale per la vita.
Le diverse fasi
Le diverse fonti di cellule staminali ematopoietiche: le cellule staminali sono presenti nel midollo, nel sangue periferico o nel cordone ombelicale dei neonati, quest’ultimo definito anche come sangue placentare.
La scelta di donare: il donatore può essere un fratello o una sorella che possiedono un sistema di compatibilità tissutale identico (sistema HLA). Può trattarsi di un donatore anonimo e non correlato, selezionato nei registri nazionali e internazionali. Le possibilità effettive di trovare un donatore adatto, data l'esistenza di 13 milioni di donatori in tutto il mondo, sono del 40-50% per un paziente in attesa di un trapianto. Esistono anche registri del sangue del cordone ombelicale che aumentano fino all’80% le probabilità di trovare un donatore compatibile.
Raccolta dal donatore: in caso di donazione di midollo osseo, la raccolta viene effettuata mediante puntura ossea delle creste iliache del donatore (osso pelvico) in anestesia generale, consentendo l'asportazione di un numero sufficiente di cellule per il normale recupero del midollo del ricevente dopo il trapianto. La quantità necessaria è dell’ordine di 10ml/kg in proporzione al peso del ricevente.
Quando si preleva un campione di cellule del sangue periferico, è necessario utilizzare un farmaco (fattore di crescita ematopoietico) per ottenere un'uscita di cellule staminali del midollo osseo nel sangue periferico, dove possono essere raccolte per citaferesi e quindi separate. La citafaresi è basata sul principio che le cellule del sangue non hanno lo stesso peso e possono quindi essere separate mediante centrifugazione. Il pretrattamento con fattore di crescita può causare dolori ossei nel donatore o dei mal di testa che scompariranno rapidamente quando il trattamento viene interrotto.
Il sangue placentare è il sangue dei neonati. Il sangue dei neonati contiene, per sua natura, una quantità abbastanza elevata di cellule somatiche ematopoietiche. Tuttavia, parte del sangue del neonato (lato placenta) non viene utilizzato per questo neonato e può quindi essere raccolto subito dopo la nascita del bambino e utilizzato nel trapianto di cellule staminali ematopoietiche. Il trapianto di sangue placentare è un generalmente più tollerabile rispetto a un trapianto di midollo osseo. In questo modo, può essere trapiantato sangue placentare che non è totalmente identico all’HLA del paziente. Questo è molto importante perché saremo in grado di effettuare trapianti a pazienti che hanno bisogno di un trapianto ma che non hanno un donatore di HLA identico, né tra i loro fratelli, né nei vari registri dei volontari per la donazione di midollo osseo. Il problema di questo tipo di trapianto è il numero relativamente piccolo di cellule iniettate, il che spiega i tempi di aplasia più lunghi e l'indicazione iniziale per i bambini piccoli. Le soluzioni sono in fase di sviluppo o modificando il trapianto o utilizzando 2 trapianti.
Condizionamento del paziente: prima che il paziente possa ricevere le cellule del donatore, le cellule del midollo osseo malato del paziente devono essere distrutte dalla chemioterapia. Gli effetti indesiderati sono dei problemi alla digestione (nausea, vomito, diarrea), ulcere alla cavità orale, perdita di capelli transitoria. Sono disponibili dei trattamenti per prevenire questi effetti.
Il processo di trapianto consiste in una semplice trasfusione di cellule staminali per il ricevente. Le cellule iniettate entrano in circolazione e vanno a depositarsi sul midollo osseo. Le due settimane successive a questa infusione sono delicate, perché il paziente non ha più cellule staminali e non può più produrre cellule del sangue, soprattutto i nuovi globuli bianchi necessari per difendersi dalle infezioni e le piastrine necessarie per prevenire il sanguinamento; e questo fino a quando le cellule staminali raccolte dal donatore si riproducono. Risultano quindi essenziali le precauzioni asettiche (camera sterile). È un momento difficile da attraversare, sia dal punto di vista fisico essendo il paziente stanco, sia dal punto di vista psicologico poiché l'attesa è lunga e ansiosa.
Complicazioni
Come in qualsiasi trapianto, c’è il rischio di rigetto anche con un donatore compatibile. Le cellule immunitarie del paziente che restano negli organi, specialmente i linfociti, possono attaccare il trapianto (rigetto), così come le cellule del trapianto possono attaccare il paziente (malattia del trapianto contro l’ospite). Queste complicanze possono portare al decesso.
Per tutte queste ragioni, è auspicabile lo sviluppo di trattamenti alternativi al trapianto del midollo osseo. In questo senso, la terapia genica, ove possibile, appare come una soluzione alternativa interessante. Utilizzando le proprie cellule del paziente evitando il rischio di malattie del trapianto contro l’ospite.
Risultati di cinque studi clinici del trapianto di midollo applicato a leucodistrofie
Tra il 1999 e il 2011, sono stato pubblicati 152 studi in tutto il mondo, descriventi dei test per trapianti di midollo con 689 pazienti affetti da leucodistrofia (adrenoleucodistrofia, leucodistrofia metacromatica e leucodistrofia di Krabbe).
I risultati indicano un beneficio del trapianto di midollo tra i pazienti che presentavano sintomi minimi o assenza di sintomi. Infatti, uno studio retrospettivo del 2007 mostra che il tasso di sopravvivenza a 5 anni dei pazienti con adrenoleucodistrofia cerebrale che hanno ricevuto un trapianto di midollo osseo è vicino al 95%, rispetto al solo 54% dei pazienti che non hanno ricevuto un trapianto. Cinque anni dopo, i sintomi sono stabili nel 53% dei pazienti trapiantati, rispetto al 6% dei pazienti non trapiantati.
Tuttavia, il trattamento non è vantaggioso per i pazienti che hanno già sviluppato sintomi più gravi. Il trapianto di midollo osseo è consigliato per i pazienti con pochi o nessun sintomo e per i quali è disponibile un donatore.
Alcune nozioni tecniche
La terapia genica comporta la riparazione di cellule malate di un paziente. Per riparare le cellulare, sono previsti due metodi:
1- o cellule staminali ematopoietiche vengono rimosse dal paziente: vengono riparate in laboratorio aggiungendo una copia del gene responsabile della malattia in buone condizioni e le cellule corrette vengono reiniettate nel paziente dopo aver effettuato la stessa chemioterapia di un trapianto di midollo osseo con un donatore: si chiama terapia genica ex vivo basata sul trapianto di cellule staminali emopoietiche.
2- o un vettore virale (oggi più spesso un AAV, un piccolo virus del DNA non patogeno) viene iniettato direttamente nel sangue o nel cervello del paziente che entrerà nelle cellule malate del cervello e riparerà queste cellule aggiungendo una versione normale del gene in questione: questa è chiamata terapia genica in vivo.
Vettori della terapia genica
Si tratta di virus. Non ne abbiamo ancora trovato uno migliore. Viene utilizzata la loro capacità di "infettare" (penetrare) le cellule con materiale genetico. Tuttavia, il materiale genetico del virus è sostituito dal gene della malattia da trattare. Questi virus non possono quindi moltiplicarsi e propagarsi. Sono definiti “non infettivi”. Ad oggi, esistono due tipi principali di vettori virali della terapia genica utilizzati. Vettori lentivirali, utilizzati per la terapia genica con cellule staminali ematopoietiche, che permettono di inserire il gene terapeutico nei cromosomi, tra gli altri geni. Vettori AAV che permettono di inserire il gene terapeutico sotto forma di anello di DNA (come nel caso del materiale genetico dei batteri) nel nucleo delle cellule. Nel primo caso, il gene terapeutico viene trasmesso a tutte le cellule figlie delle cellule corrette, se si dividono, e a tutte le cellule da esse derivate. Nel secondo caso, il gene terapeutico viene trasmesso solo al 50% delle cellule figlie, e se le cellule corrette si dividono molto, il gene terapeutico alla fine si perde.
Applicazione alle leucodistrofie
La terapia genica delle cellule staminali ematopoietiche è limitata a tre sole leucodistrofie: adrenoleucodistrofia (ALD), leucodistrofia metacromatica (MLD) e forse leucodistrofia di Krabbe. Dopo il trapianto di cellule staminali ematopoietiche e il ripristino del midollo osseo, una sottopopolazione di cellule specializzate si sposta nel cervello e si trasforma in cellule chiamate cellule microgliali. Nel caso della leucodistrofia metacromatica e della leucodistrofia di Krabbe, le cellule microgliali producono l'enzima lisosomiale normale (ARSA nella leucodistrofia metacromatica e GALC nella leucodistrofia di Krabbe). L'enzima prodotto può essere recuperato da altre cellule non corrette, in particolare dagli oligodendrociti. L'adrenoleucodistrofia non è causata da una carenza di un enzima, ma da una proteina che rimane nelle cellule e contribuisce alla degradazione di acidi grassi a catena molto lunga. In adrenoleucodistrofia, il trapianto di cellule staminali ematopoietiche con un donatore o la terapia genica di cellule staminali ematopoietiche ripara solo le cellule microgliali del cervello, non gli oligodendrociti. Tuttavia, questo è sufficiente per fermare il processo di demielinizzazione cerebrale.
Per tutti gli altri tipi di leucodistrofia, è necessario mettere il gene terapeutico direttamente nelle cellule del cervello: oligodendrociti, astrociti o entrambi. Pertanto, è necessario un vettore di terapia genica in grado di penetrare queste cellule, sia che il vettore venga iniettato direttamente nel cervello o per via endovenosa. Per alcune forme di leucodistrofia (malattia di Pelizaeus-Merzbacher dovuta a duplicazioni del gene PLP, malattia di Alexander dovuta a mutazioni del gene GFAP che danno alle cellule malate una nuova funzione), non è necessario mettere una copia del gene normale ma introdurre materiale genetico (il più delle volte derivato dall'RNA) che può ridurre l'espressione genica mutata.
Scelta dei vettori e metodo di somministrazione
La scelta dei vettori utilizzati per veicolare il gene del farmaco dipende dal tipo di cellula da correggere e quindi dal tipo di leucodistrofia. Nel caso della terapia genica con cellule staminali del midollo osseo, non c'è altra scelta se non quella di utilizzare un lentivirus. Ma questo mette il gene terapeutico in altri cromosomi e in altri geni, senza controllo. Vi è quindi il rischio di interrompere il normale ciclo di crescita delle cellule del midollo osseo e di indurre una leucemia con altri fattori aggiunti. Alcune complicazioni di questo genere sono state osservate in più di 30 pazienti finora trattati. Il vettore deve essere in grado di portare un gene terapeutico di grandi dimensioni se il gene della malattia è grande. Questo è il caso dei lentivirus, ma non dei vettori AAV. Quando viene iniettato per via endovenosa, il vettore della terapia genica deve essere in grado di superare la barriera ematoencefalica per raggiungere il cervello. Questo è il caso di alcuni tipi di AAV, non tutti gli AAV, e i lentivirus non superano la barriera ematoencefalica o la superano con risultati non soddisfacenti. Il vettore può essere iniettato direttamente nel cervello o addirittura nel liquido cerebrospinale (come in una puntura lombare). Ma la diffusione dei vettori dai siti di iniezione/penetrazione nel tessuto cerebrale è bassa e richiede iniezioni intracerebrali multiple. Questo aumenta il rischio di causare un ematoma intracerebrale. Per le iniezioni endovenose e intratecali (nel liquido cerebrospinale), è necessario determinare la quantità di virus da iniettare e verificare che il virus non sia tossico per altri organi, dal momento che siamo obbligati ad iniettare grandi quantità di virus.
La barriera ematoencefalica
Poiché è così importante per il funzionamento del corpo nel suo complesso, il cervello è ben protetto. Esso è immerso in un liquido e protetto dal cranio. C'è uno stretto contatto tra sangue e cellule in tutti gli organi. Il cervello rappresenta un’eccezione. Esiste una barriera funzionante come una “dogana” che controlla le entrate e le uscite. Questa è la barriera ematoencefalica, composta da cellule provenienti da vasi cerebrali, astrociti e cellule specializzate chiamate periciti. E anche se è lì per proteggere il cervello, questa barriera limita anche l'accesso ai trattamenti sviluppati dai medici.
Nel caso della terapia genica endovenosa applicata alle leucodistrofie, il passaggio della barriera ematoencefalica rappresenta una sfida importante. I ricercatori stanno lavorando per modificare gli involucri dei virus per consentire loro di superare questa barriera ematoencefalica.
Risultati degli studi clinici di terapia genica applicata alle leucodistrofie
In totale, 42 bambini (21 ALD, 20 MLD, 13 leucodistrofie di Canavan) hanno partecipato a questi studi clinici di terapia genica.
• Nell’adrenoleucodistrofia (ALD)
I primi studi di terapia genica contro l'adrenoleucodistrofia, fortemente finanziati dall'ELA, sono stati condotti dalla squadra del professor Aubourg in quattro pazienti con adrenoleucodistrofia con danno cerebrale per i quali non era disponibile un donatore compatibile. Hanno dimostrato che la terapia era fattibile e ben tollerata. Infatti, per la prima volta al mondo, le cellule staminali ematopoietiche raccolte da pazienti con adrenoleucodistrofia cerebrale sono state modificate ex vivo per correggere il difetto genetico che ha causato la malattia, prima di essere reiniettate nei pazienti. Questo approccio innovativo alla terapia genica ha permesso di arrestare la progressione della malattia da 14 a 16 mesi dopo l'iniezione in 3 dei 4 pazienti trattati con risultati simili in termini di efficacia al trapianto di midollo osseo con cellule staminali ematopoietiche.
Questo trattamento di terapia genica è attualmente in fase di sperimentazione (Fase II/III) in altri 17 pazienti e sarà esteso ad altri bambini. Come per il trapianto di cellule staminali ematopoietiche con un donatore, può essere offerto solo a pazienti con adrenoleucodistrofia che non hanno sintomi avanzati della forma cerebrale della malattia e quando nessun fratello o sorella risulti compatibile per consentire un trapianto di midollo.
• Nella leucodistrofia metacromatica (MLD)
Studi clinici di terapia genica sono stati condotti dal team del Dr. Biffi in Italia su 20 pazienti con leucodistrofia metacromatica. È stato dimostrato che il trattamento era ben tollerato dai pazienti. I primi risultati mostrano anche che il beneficio clinico è possibile nei pazienti trattati nella fase pre-sintomatica, diversi mesi prima della comparsa dei primi sintomi motori. Non è chiaro se l'efficacia venga osservata in pazienti che hanno già sintomi, come ad esempio dopo il trapianto di cellule staminali ematopoietiche. Questo probabilmente perché la malattia progredisce troppo rapidamente e ci vogliono almeno 12 mesi prima di ottenere un numero sufficiente di cellule microgliali corrette per avere un effetto clinico.
• Nella leucodistrofia di Canavan
Non è stato ottenuto alcun chiaro beneficio terapeutico. Va detto, tuttavia, che questo vecchio studio è stato condotto con un tipo di vettore AAV a basse prestazioni che non viene più utilizzato e che i pazienti trattati avevano una forma molto avanzata della loro malattia.
Conclusioni
Con più di venticinque anni di esperienza, i risultati indicano un beneficio del trapianto di midollo osseo in pazienti con adrenoleucodistrofia, in bambini con forme tardive di leucodistrofia metacromatica (leucodistrofia cosiddetta "giovanile") e leucodistrofia di Krabbe quando il trapianto viene eseguito alla nascita per forme precoci o in forme tardive della malattia. In tutti i casi, i risultati indicano chiaramente che il trapianto non ha effetto sui bambini con sintomi evidenti della malattia. Funziona solo all'inizio della malattia, in pratica quando i pazienti non hanno ancora sintomi evidenti.
Prospettive
Gli studi di terapia genica in pazienti con adrenoleucodistrofia e leucodistrofia metacromatica sono davvero promettenti. Ma anche in questo caso, questi trattamenti riguardano solo i bambini trattati all'inizio della loro malattia o meglio senza sintomi. È in corso uno studio di terapia genica, finanziato dall'ELA, basato sull'iniezione intracerebrale del vettore AAV in leucodistrofia metacromatica (Prof. Aubourg). Per la leucodistrofia di Krabbe, gli studi sono ancora in fase preclinica, in topi, cani o scimmie. Per tutte le altre leucodistrofie, si dovrebbe sviluppare una strategia specifica di terapia genica. Non tutte le leucodistrofie saranno trattabili con terapia genica.
I primi passi verso la terapia genica nel trattamento delle leucodistrofie sono stati resi possibili soprattutto grazie alle donazioni all'ELA per sostenere la ricerca contro le leucodistrofie.
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