Zweck einer Knochenmarktransplantation ist es, im Knochenmark und Blut eines kranken Patienten enthaltene Zellen durch die eines gesunden Spenders zu ersetzen. Ziel der Gentherapie ist es, die kranken Zellen eines Patienten zu reparieren, indem man ihnen eine intakte Version des für die Entstehung der Krankheit ursächlichen Gens einsetzt. Es existieren Möglichkeiten, ein Gen im wahrsten Sinne des Wortes zu reparieren (insbesondere mit der CRISPR/Case9-Technik), nur werden sie in der Praxis noch nicht angewandt.
Das Knochenmark und die Blutstammzellen
Das Knochenmark ist ein diffuses Organ im Inneren der Knochen. Es ist eine Fabrik, in der Milliarden von zellulären Blutbestandteilen hergestellt werden. Sie entstehen dort und vermehren sich. Im Blut zirkulieren drei wesentliche Zellgruppen: rote Blutkörperchen, die für den Sauerstofftransport zuständig sind, weiße Blutkörperchen (Granulozyten, Lymphozyten und Monozyten), die Infektionen abwehren, und Blutplättchen, die für die Blutgerinnung sorgen und somit zur Blutstillung führen.
Das Knochenmark stellt diese Bestandteile aus speziellen Zellen, den so genannten Blutstammzellen her. Diese Zellen, die man als undifferenziert bezeichnet, sind eine Art Grundgerüst, das verwendet werden kann, um das herzustellen, was der Körper braucht. Durch Zellteilung und zunehmende Differenzierung können sich diese Zellen nämlich zu roten Blutkörperchen, weißen Blutkörperchen und Blutplättchen weiterentwickeln. Rote Blutkörperchen und Blutplättchen haben eine relativ lange Lebenszeit (120 Tage für rote Blutkörperchen und 10 Tage für Blutplättchen) Granulozyten und Monozyten hingegen haben eine kürzere Lebenszeit und erneuern sich schneller. Bei Bedarf wird die Reserve mobilisiert und die Zellproduktion intensiviert. Das Knochenmark ist lebenswichtig.
Ablauf einer Spende
Die verschiedenen Quellen von hämatopoetischen Stammzellen: Stammzellen befinden sich im Knochenmark, im peripheren Blut oder im Plazentarestblut, das in der Nabelschnur von Neugeborenen enthalten ist.
Die Wahl des Spenders: Der Spender kann ein gesunder Bruder oder eine gesunde Schwester mit einem identischen Gewebeverträglichkeitssystem (kompatible HLA-Merkmale) sein. Möglich ist auch ein nicht verwandter, anonymer Spender aus nationalen oder internationalen Registern. In Anbetracht von 13 Millionen Spendern weltweit liegen die aktuellen Chancen, einen geeigneten Spender für einen Patienten zu finden, der auf eine Transplantation wartet, bei 40-50 %. Es gibt auch Register für Nabelschnurblut, die die Wahrscheinlichkeit, einen kompatiblen Spender zu finden, auf mindestens 80 % erhöhen.
Entnahme beim Spender: Im Falle einer Knochenmarkspende erfolgt die Entnahme durch Punktion der Beckenkämme (Beckenknochen) des Spenders in Vollnarkose. Auf diese Weise können genügend Zellen entnommen werden, damit sich das Empfängermark nach der Transplantation normal regeneriert. Pro Kilogramm Körpergewicht des Empfängers sind ungefähr 10 ml erforderlich.
Erfolgt die Spende durch periphere Stammzellapherese, d.h. durch Entnahme von Stammzellen aus dem peripheren Blut, ist die Vorbehandlung mit einem Medikament (einem blutbildenden Wachstumsfaktor) erforderlich, damit Stammzellen aus dem Knochenmark in das periphere Blut ausgeschwemmt werden, wo sie durch Zytapherese gesammelt und dann getrennt werden können. Die Zytapherese beruht auf dem Prinzip, dass nicht alle Blutzellen das gleiche Gewicht haben und daher durch Zentrifugation getrennt werden können. Die Vorbehandlung mit einem Wachstumsfaktor kann beim Spender zu Knochenschmerzen führen, die nach Beendigung der Behandlung schnell abklingen.
Plazentarestblut ist das Blut des Neugeborenen. Das Blut von Neugeborenen ist von Natur aus reich an hämatopoetischen (blutbildenden) Stammzellen. Das Plazentarestblut braucht das Neugeborene aber nicht, deshalb kann es sofort nach der Abnabelung entnommen werden und als hämatopoetisches Stammzelltransplantat dienen. Tatsache ist, dass Plazentarestblut im Allgemeinen besser toleriert wird als ein Knochenmarktransplantat. So können Plazentarestblut-Transplantate verwendet werden, die nicht ganz HLA-identisch mit dem Patienten sind. Das ist sehr wichtig, denn wir werden Patienten transplantieren können, die eine Transplantation benötigen, aber für die es keinen Spender mit identischen HLA-Merkmalen gibt, weder unter den Geschwistern noch in den diversen Registern freiwilliger Knochenmarkspender. Das Problem bei dieser Transplantationsform ist die relativ geringe Anzahl der injizierten Zellen, weshalb die Aplasiezeiten länger sind und diese Form die Erstindikation für Kleinkinder darstellt. Zurzeit wird an Lösungen gearbeitet, indem man entweder das Transplantat manipuliert oder 2 Transplantate verwendet
Vorbehandlung des Empfängers: Bevor der Patient die Spenderzellen erhalten kann, müssen die kranken Knochenmarkszellen des Patienten durch Chemotherapie zerstört werden. Nebenwirkungen sind Verdauungsstörungen (Übelkeit, Erbrechen, Durchfall), Geschwüre in der Mundhöhle, vorübergehender Haarausfall. Zur Vorbeugung und Linderung dieser Auswirkungen gibt es Behandlungen.
Die Übertragung des Transplantats erfolgt durch eine einfache Transfusion des Empfängers mit Stammzellen. Die injizierten Zellen zirkulieren im Blut und setzen sich dann im Knochenmark fest. Die zwei Wochen nach dieser Transfusion sind heikel, weil der Patient keine Stammzellen mehr hat und somit keine Blutzellen mehr herstellen kann – weder neue weiße Blutkörperchen, die er zur Abwehr von Infektionen braucht, noch Blutplättchen, die zur Vermeidung von Blutungen notwendig sind – und zwar so lange, bis sich die Stammzellen des Spenders vermehren. Unter diesen Umständen ist absolute Keimfreiheit (steriles Zimmer) unerlässlich. Dieser Zeitraum ist für den Patienten sowohl körperlich als auch psychisch schwer zu ertragen, denn er ist müde und empfindet die Wartezeit als lang und beängstigend.
Komplikationen
Wie bei jeder Transplantation besteht auch bei einem kompatiblen Spender die Gefahr der Abstoßung. Die in den Organen verbleibenden Immunzellen des Patienten, vornehmlich Lymphozyten, können das Transplantat angreifen (Abstoßung), ebenso wie die Transplantatzellen den Patienten angreifen können (Spender-gegen-Empfänger-Reaktion). Manchmal können diese Komplikationen zum Tod führen.
Aus all diesen Gründen ist die Entwicklung alternativer Behandlungen zur Knochenmarktransplantation wünschenswert. In diesem Sinne erscheint die Gentherapie, falls sie ermöglicht wird, als eine interessante Alternative. Durch die Verwendung patienteneigener Zellen wird das Risiko der Abstoßungsreaktion und der Spender-gegen-Empfänger-Reaktion vermieden.
Anwendung der Ergebnisse klinischer Tests zur Knochenmarktransplantation auf Leukodystrophien
Zwischen 1999 und 2011 wurden weltweit 152 Studien veröffentlicht, die Tests von Knochenmarktransplantationen an 689 Patienten mit Leukodystrophie (Adrenoleukodystrophie, metachromatische Leukodystrophie und Morbus Krabbe) beschreiben.
Die Ergebnisse deuten auf einen Nutzen der Knochenmarktransplantation bei Patienten hin, die wenige oder keine Symptome aufweisen. Eine retrospektive Studie aus dem Jahr 2007 zeigt nämlich, dass die Überlebensrate nach 5 Jahren von Patienten mit zerebraler Adrenoleukodystrophie, die eine Knochenmarktransplantation erhielten, bei 95 % liegt, gegenüber nur 53 % bei Patienten, die keine Transplantation erhielten. Fünf Jahre später sind die Symptome bei 53 % der Transplantationspatienten stabil, wohingegen nur bei 6% der nicht transplantierten Patienten eine Stabilisierung festzustellen ist.
Die Behandlung ist allerdings nicht vorteilhaft für Patienten, die schon schwerwiegendere Symptome entwickelt haben. Eine Knochenmarktransplantation wird Patienten empfohlen, die wenige oder keine Symptome aufweisen und für die es einen Spender gibt.
1- Bei der Gentherapie werden die kranken Zellen eines Patienten repariert. Zur Reparatur der Zellen, sind zwei Methoden möglich:
Entweder entnimmt man dem Patienten hämatopoetische Stammzellen und repariert sie im Labor, indem man eine fehlerfreie Kopie des für die Krankheit ursächlichen Gens hinzugefügt und die korrigierten Zellen dem Patienten wieder infundiert, nachdem dieser die gleiche Chemotherapie erhielt wie bei einer Knochenmarktransplantation mit einem Spender. Dieses Verfahren bezeichnet man als Ex-vivo-Gentherapie auf der Grundlage einer hämatopoetischen Stammzellen-Transplantation.
2- Oder man injiziert einen viralen Vektor (heutzutage meist AAV, ein kleines Virus mit einer nicht pathogenen DNS) direkt in das Blut oder Gehirn des Patienten. Der virale Vektor dringt in die erkrankten Zellen des Gehirns ein und repariert sie, indem er eine intakte Version des defekten Gens hinzufügt. Dies wird In-vivo-Gentherapie genannt.
Die Vektoren der Gentherapie
Das sind Viren. Etwas Besseres gibt es bisher noch nicht. Man nutzt ihre Fähigkeit, Zellen mit genetischem Material zu "infizieren“ (in sie einzudringen). Doch ersetzt man das genetische Material des Virus durch das Gen der zu behandelnden Krankheit. So können sich diese Viren nicht vermehren und verbreiten. Sie werden als "nicht ansteckend" bezeichnet. Derzeit werden zwei Haupttypen von viralen Gentherapievektoren verwendet. Lentivirale Vektoren für die Gentherapie mit hämatopoetischen Stammzellen, die es ermöglichen, das therapeutische Gen in die Chromosomen, zwischen die anderen Gene zu setzen. AAV-Vektoren, die es ermöglichen, das therapeutische Gen in Form eines DNS-Rings (wie es beim genetischen Material von Bakterien der Fall ist) im Zellkern von Zellen zu platzieren. Im ersten Fall wird das therapeutische Gen auf alle Tochterzellen der korrigierten Zellen übertragen, wenn diese sich teilen, sowie auf alle aus ihnen gebildeten Zellen. Im zweiten Fall wird das therapeutische Gen nur auf 50 % der Tochterzellen übertragen, und wenn sich die korrigierten Zellen sehr oft teilen, geht das therapeutische Gen schließlich verloren.
Anwendung bei Leukodystrophien
Die Gentherapie hämatopoetischer Stammzellen ist auf nur drei Leukodystrophien beschränkt: Adrenoleukodystrophie (ALD), metachromatische Leukodystrophie (MLD) und möglicherweise Morbus Krabbe. Nach der Transplantation hämatopoetischer Stammzellen und der Regeneration des Knochenmarks wandert eine Untergruppe spezialisierter Zellen ins Gehirn und verwandelt sich dort in so genannte Mikrogliazellen. Bei metachromatischer Leukodystrophie und Morbus Krabbe produzieren die Mikrogliazellen das normale lysosomale Enzym (ARSA bei der metachromatischen Leukodystrophie und GALC bei Morbus Krabbe). Das produzierte Enzym kann von anderen nicht korrigierten Zellen, insbesondere von Oligodendrozyten, aufgenommen werden. Die Adrenoleukodystrophie beruht nicht auf dem Mangel eines Enzyms, sondern eines Proteins, das in den Zellen lokalisiert ist und zum Abbau von sehr langkettigen Fettsäuren beiträgt. Bei der Adrenoleukodystrophie werden durch Transplantation hämatopoetischer Stammzellen eines Spenders oder durch Gentherapie hämatopoetischer Stammzellen nur die Mikrogliazellen im Gehirn und nicht die Oligodendrozyten repariert. Doch genügt dies, um die Zerstörung der Myelinfasern im Gehirn zu stoppen.
Bei allen anderen Leukodystrophien muss das therapeutische Gen direkt in die Gehirnzellen – Oligodendrozyten, Astrozyten oder beides – eingebracht werden. Daher wird ein Gentherapievektor benötigt, der in diese Zellen eindringen kann, ob der Vektor direkt in das Gehirn oder intravenös injiziert wird. Bei einigen Formen der Leukodystrophie (Pelizaeus-Merzbacher-Krankheit aufgrund von Duplikationen des PLP-Gens, Alexander-Krankheit aufgrund von Mutationen im GFAP-Gen, die kranken Zellen eine neue Funktion geben) muss nicht eine fehlerfreie Kopie des Gens, sondern genetisches Material (meist aus RNS) injiziert werden, das die Expression des mutierten Gens abschwächen kann.
Wahl der Vektoren und Applikationsverfahren
Die Wahl der Vektoren, die das Arzneimittelgen tragen, hängt von der Art der zu korrigierenden Zelle und damit von der Art der Leukodystrophie ab. Bei der Gentherapie mit Stammzellen des Knochenmarks gibt es keine andere Wahl, als ein Lentivirus zu verwenden. Dieses aber setzt das therapeutische Gen an irgendeine Stelle in den Chromosomen, einfach irgendwo zwischen die anderen Gene. Es besteht daher die Gefahr, den normalen Wachstumszyklus der Knochenmarkszellen zu stören und unter dem Einfluss noch anderer Faktoren eine Leukämie zu verursachen. Bislang wurden jedoch bei mehr als 30 behandelten Patienten keine derartigen Komplikationen beobachtet. Wenn das Krankheitsgen groß ist, muss der Vektor in der Lage sein, ein großes therapeutisches Gen zu tragen. Dies ist bei Lentiviren der Fall, nicht aber bei AAV-Vektoren. Bei intravenöser Injektion muss der Gentherapievektor die Blut-Hirn-Schranke passieren können, um ins Gehirn zu gelangen. Einige Arten von AAVs, aber nicht alle, erfüllen diese Bedingung, während Lentiviren die Blut-Hirn-Schranke nicht oder nur sehr schlecht passieren. Der Vektor kann direkt in das Gehirn oder sogar in die Zerebrospinalflüssigkeit (das Gehirnwasser) injiziert werden (wie bei einer Lumbalpunktion). Von den Injektions-/Penetrationsstellen aus verteilen sich die Vektoren allerdings nur schwach im Hirngewebe, weshalb mehrere intrathekale Injektionen (in den Liquorraum) nötig sind. Dadurch steigt das Risiko, eine Hirnblutung zu verursachen. Bei intravenösen und intrathekalen Injektionen (in die Zerebrospinalflüssigkeit) ist es notwendig, die Menge des zu injizierenden Virus zu bestimmen und zu überprüfen, ob das Virus für andere Organe nicht toxisch ist, da sehr große Virusmengen injiziert werden müssen.
Die Blut-Hirn-Schranke
Das Gehirn ist gut geschützt, weil es für die Funktion des gesamten Körpers extrem wichtig ist. Es schwimmt in einer Flüssigkeit und ist im Schädel eingekapselt. In allen Organen besteht ein enger Kontakt zwischen Blut und Zellen. Doch das Gehirn ist eine Ausnahme. Es existiert eine Barriere, die Zu- und Abgänge kontrolliert, wie beispielsweise eine Zollstation. Das ist die Blut-Hirn-Schranke, die aus den Zellen der Hirngefäße sowie den Astrozyten und spezialisierten Zellen, den Perizyten besteht. Und obwohl diese Barriere zum Schutz des Gehirns dient, erschwert sie auch ärztlichen Therapien den Zugang.
Im Fall der intravenösen Gentherapie bei Leukodystrophien stellt die Überwindung der Blut-Hirn-Schranke eine große Herausforderung dar. Forscher arbeiten daran, die Hülle von Viren so zu verändern, dass sie diese Blut-Hirn-Schranke passieren können.
Ergebnisse klinischer Tests der Gentherapie bei Leukodystrophien
Insgesamt 42 Kinder (21 ALDs, 20 MLDs, 13 Morbus Canavan) nahmen an klinischen Gentherapie-Tests teil.
• Bei Adrenoleukodystrophie (ALD)
Die ersten Gentherapie-Tests zur Bekämpfung von Adrenoleukodystrophie, die ELA maßgeblich finanzierte, führte das Team von Prof. Aubourg an vier Adrenoleukodystrophie-Patienten mit zerebraler Verlaufsform durch, für die kein geeigneter Spender zur Verfügung stand. Diese Tests zeigten, dass die Therapie durchführbar und gut verträglich war. Tatsächlich wurden weltweit zum ersten Mal hämatopoetische Stammzellen, die von Patienten mit zerebraler Adrenoleukodystrophie entnommen wurden, ex vivo modifiziert, um den Gendefekt zu korrigieren, der die Krankheit verursacht hat, bevor sie den Patienten wieder injiziert wurden. Dieser innovative Ansatz der Gentherapie hat es ermöglicht, das Fortschreiten der Krankheit 14 bis 16 Monate nach der Injektion bei 3 der 4 behandelten Patienten zu stoppen. Diese Ergebnisse sind vergleichbar mit der Wirksamkeit der Transplantation hämatopoetischer Knochenmark-Stammzellen.
Dieses gentherapeutische Verfahren wird derzeit (Phase II/III) an 17 weiteren Patienten getestet und auf weitere Kinder ausgedehnt werden. Wie bei der Transplantation hämatopoetischer Stammzellen eines Spenders kann es nur Patienten angeboten werden, die keine fortgeschrittenen Symptome der zerebralen Adrenoleukodystrophie aufweisen, und wenn die Geschwister nicht kompatibel sind und deshalb keine Knochenmark-Transplantation möglich ist.
• Bei metachromatischer Leukodystrophie (MLD)
Das Team von Dr. Biffi in Italien führte klinische Gentherapie-Tests an 20 Patienten mit metachromatischer Leukodystrophie durch. Sie zeigten, dass die Behandlung von den Patienten gut vertragen wurde. Erste Ergebnisse zeigen auch, dass Patienten, die im präsymptomatischen Stadium behandelt werden, also mehrere Monate vor Auftreten der ersten motorischen Symptome, einen klinischen Nutzen aus der Behandlung ziehen. Die Wirksamkeit bei Patienten, die bereits Symptome haben, ist nicht eindeutig erwiesen, wie auch nach einer Transplantation hämatopoetischer Stammzellen. Wahrscheinlich liegt das daran, dass die Krankheit zu schnell fortschreitet und es mindestens 12 Monate dauert, bis eine ausreichende Anzahl von korrigierten Mikrogliazellen vorhanden ist, um eine klinische Wirkung zu erzielen.
• Bei Morbus Canavan
Es wurde kein offensichtlicher therapeutischer Nutzen erzielt. Bemerkenswert ist allerdings, dass dieser alte Test mit einem nicht mehr verwendeten, leistungsschwachen AAV-Vektor durchgeführt wurde und dass die behandelten Patienten eine sehr fortgeschrittene Verlaufsform ihrer Krankheit hatten.
Schlussfolgerungen
Nach über 25 Jahren Erfahrung deuten die Ergebnisse auf einen positiven Effekt der Knochenmarktransplantation bei Patienten mit Adrenoleukodystrophie, bei Kindern mit späten Formen der metachromatischen Leukodystrophie (so genannte "jugendliche" Formen) und bei Morbus Krabbe hin, und zwar gilt das für frühe Formen oder spät auftretende Formen der Krankheit, wenn die Transplantation bei der Geburt erfolgt. In allen Fällen deuten die Ergebnisse eindeutig darauf hin, dass die Transplantation keinerlei Wirkung auf Kinder mit offensichtlichen Krankheitssymptomen hat. Sie funktioniert nur ganz am Anfang der Erkrankung, in der Praxis vor allem dann, wenn die Patienten noch keine offensichtlichen Symptome aufweisen.
Ausblick in die Zukunft
Gentherapie-Tests, die an Patienten mit Adrenoleukodystrophie und metachromatischer Leukodystrophie durchgeführt werden, sind durchaus vielversprechend. Allerdings handelt es sich bei diesen Behandlungen nur um Kinder, die ganz am Anfang ihrer Krankheit oder im Idealfall symptomfrei behandelt werden. Ein von der ELA finanzierter Gentherapie-Test, der auf einer Injektion des AAV-Vektors in das Gehirn basiert, läuft derzeit bei metachromatischer Leukodystrophie (Pr. Aubourg). Bei Morbus Krabbe befinden sich die Studien noch in der präklinischen Phase, also bei Mäusen, Hunden oder Affen. Für alle anderen Leukodystrophien sollte eine spezifische Gentherapie-Strategie entwickelt werden. Nicht alle Leukodystrophien werden mithilfe von Gentherapie behandelbar sein.
Erste Schritte in Richtung Gentherapie bei der Behandlung von Leukodystrophien wurden größtenteils durch Spenden an die ELA zur Unterstützung der Forschung auf dem Gebiet der Leukodystrophien ermöglicht.
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