La greffe de moelle osseuse et la thérapie génique comme traitement des leucodystrophies

 

Dans cet article seront d’abord exposées les procédures de la greffe de moelle osseuse et de la thérapie génique, avant de décrire les applications et les résultats obtenus dans les leucodystrophies.

 

L’objectif de la greffe de moelle osseuse est de remplacer les cellules de la moelle osseuse et du sang d’un patient malade par celles prélevées chez une personne saine. L’objectif de la thérapie génique est de réparer les cellules malades d’un patient en y introduisant une version normale du gène impliqué dans la maladie. Il existe des possibilités de réparer un gène au sens vrai du terme (notamment avec la technique CRISPR/Cas9), mais elles ne sont pas encore utilisées en clinique.

La greffe de moelle osseuse 

La greffe de moelle osseuse « allogénique », c’est-à-dire issue d’un donneur, consiste à remplacer les cellules déficientes de la moelle osseuse d’une personne malade par celles d’un donneur sain.

 

La moelle osseuse et les cellules souches hématopoïétiques.

La moelle osseuse est un organe diffus situé à l’intérieur des os. C’est une usine dans la quelle sont fabriqués des milliards d’éléments cellulaires du sang qui y naissent et s’y multiplient. Trois grandes familles de cellules circulent dans le sang : les globules rouges responsables du transport de l’oxygène, les globules blancs (polynucléaires, lymphocytes et monocytes) garants de la défense contre les infections et les plaquettes chargées de prévenir les hémorragies en activant la coagulation.

La moelle osseuse fabrique ces différents éléments à partir de cellules spéciales, appelées cellules souches hématopoïétiques. Ces cellules, dites indifférenciées, sont comme un canevas qui peut servir à fabriquer ce dont l’organisme a besoin. Ces cellules sont en effet capables de se multiplier et de se différencier en globules rouges, globules blancs ou plaquettes. Les globules rouges et les plaquettes ont une demi-vie relativement longue (120 jours pour les rouges et 10 jours pour les paquettes). Les polynucléaires et les monocytes en revanche ont une demi-vie plus courte  et se renouvellent rapidement. En cas de besoin, la réserve est mobilisée et la fabrication des cellules s’intensifie. La moelle osseuse est indispensable à la vie.

 

Les différentes étapes

Les différentes sources de cellules souches hématopoïétiques : des cellules souches sont présentes dans la moelle, le sang périphérique ou dans le cordon ombilical des nouveau-nés, encore appelé sang placentaire.

Le choix du donneur : le donneur peut être un frère ou une sœur non atteint avec un système de compatibilité tissulaire identique (système HLA). Il peut s’agir d’un donneur non apparenté, anonyme recherché dans les registres nationaux et internationaux. Les chances actuelles, compte tenu de l’existence de 13 millions de donneurs dans le monde, sont de 40-50% pour trouver un donneur compatible pour un patient en attente de greffe. Il existe aussi des registres de sang de cordon qui augmentent la probabilité de trouver un donneur compatible à au moins 80%.

Le prélèvement du donneur : dans le cas d’un don de moelle osseuse, le prélèvement se fait par ponctions osseuses des crêtes iliaques (os du bassin) du donneur sous anesthésie générale, permettant de retirer une quantité́ de cellules suffisante pour une récupération normale de la moelle du receveur après la greffe. La quantité́ nécessaire est de l’ordre de 10 ml/kg de poids du receveur.

Lorsque le prélèvement s’effectue à partir des cellules du sang périphérique, il est nécessaire d’utiliser un médicament (un facteur de croissance hématopoïétique) pour obtenir une sortie des cellules souches de la moelle osseuse dans le sang périphérique, où elles pourront être collectées par cytaphérèse puis séparées. La cytaphérèse est basée sur le principe que les cellules sanguines n’ont pas le même poids et pourront donc être séparées par centrifugation. Le traitement préalable par un facteur de croissance peut provoquer chez le donneur des douleurs osseuses, des maux de tète qui disparaitront rapidement à l’arrêt du traitement.

Le sang placentaire est le sang du nouveau né. De manière naturelle, le sang des nouveau-nés contient une assez grande quantité de cellules souches hématopoïétiques. Or, une partie du sang de nouveau né (côté placenta) ne sert pas à ce nouveau-né et peut donc être prélevé juste après la naissance de l’enfant et servir comme un greffon de cellules souches hématopoïétiques. Le fait est que le sang placentaire est un greffon globalement plus tolérant qu’un greffon de moelle osseuse. Ainsi peut-on utiliser des greffons de sang placentaire qui ne sont pas totalement HLA identiques au malade. Ceci est très important puisque nous allons ainsi pouvoir greffer des patients qui ont besoin d’une greffe mais qui n’ont pas de donneur HLA identique, ni dans leur fratrie, ni sur les différents registres de volontaires pour le don de moelle osseuse. L’écueil de ce type de greffe est la relativement faible quantité de cellules injectées qui explique les durées d’aplasie plus longue et l’indication initiale aux petits enfants. Des solutions sont en cours d’élaboration soit en manipulant le greffon, soit en utilisant 2 greffons.

Le conditionnement du receveur : avant que le malade ne puisse recevoir les cellules du donneur, les cellules médullaires malades du patient doivent être détruites par chimiothérapie. Les effets indésirables sont des troubles digestifs (nausées, vomissements, diarrhées), des ulcérations de la cavité buccale, une perte transitoire des cheveux. Des traitements sont dispensés pour prévenir et traiter ces effets.

Le passage du greffon consiste en une simple transfusion de cellules souches pour le receveur. Les cellules injectées vont circuler, puis s’implanter dans la moelle osseuse. Les deux semaines suivant cette perfusion sont délicates, car le patient n’a plus de cellules souches et ne peut plus fabriquer les cellules du sang, en particulier les nouveaux globules blancs nécessaires pour se défendre contre les infections et les plaquettes nécessaires pour éviter les hémorragies ; et ceci jusqu’à ce que les cellules souches prélevées chez le donneur se reproduisent. Les précautions d’asepsie (chambre stérile) sont alors indispensables. C’est un moment difficile à passer, physiquement car le malade est fatigué et psychologiquement car l’attente est longue et angoissante.

Les complications.

Comme après toute greffe, même avec un donneur compatible, les risques de rejet existent. Les cellules immunitaires du patient qui restent dans les organes, lymphocytes notamment, peuvent attaquer le greffon (rejet), de même que les cellules du greffon peuvent attaquer le patient (maladie du greffon contre l’hôte). Ces complications peuvent parfois conduire au décès.

 

Pour toutes ces raisons, le développement de traitements alternatifs à la greffe de moelle osseuse est souhaitable. En ce sens, la thérapie génique si elle est rendue possible, apparait comme une solution alternative intéressante. En utilisant les propres cellules du patient, on évite le risque de rejet et de maladie du greffon contre l’hôte.

Les résultats des essais cliniques de la greffe de moelle appliquée aux leucodystrophies

Entre 1999 et 2011, 152 études ont été publiées dans le monde, décrivant des essais de greffe de moelle chez 689 patients atteints de leucodystrophie (adrénoleucodystrophie, leucodystrophie métachromatique et leucodystrophie de Krabbe).

Les résultats indiquent un bénéfice de la greffe de moelle chez les patients présentant peu ou pas de symptômes. En effet, une étude rétrospective de 2007 montre que la survie à 5 ans des patients atteints d’adrénoleucodystrophie cérébrale ayant reçus une greffe de moelle est voisine de 95%, contre seulement 54% chez les patients n’ayant pas été greffés. Cinq ans après, les symptômes sont stables chez 53% des patients greffés, contre seulement 6% chez les patients non greffés.

Le traitement n’est en revanche pas bénéfique pour les patients ayant déjà développé des symptômes plus importants. La greffe de moelle est recommandée pour les patients ayant peu ou pas de symptômes et pour qui un donneur est disponible.

La thérapie génique 

Quelques notions techniques

La thérapie génique implique la réparation des cellules malades d’un patient. Pour réparer les cellules, deux méthodes sont envisageables :

1. soit on prélève chez le patient des cellules souches hématopoïétiques : on les répare en laboratoire en ajoutant une copie en bon état du gène responsable de la maladie et on réinjecte les cellules corrigées chez le patient après avoir effectué la même chimiothérapie que pour une greffe de moelle osseuse avec un donneur : c’est ce qu’on appelle la thérapie génique ex vivo basée sur la greffe de cellules souches hématopoïétiques.

2. soit on injecte un vecteur viral (aujourd’hui le plus souvent un AAV, petit virus à ADN non pathogène) directement dans le sang ou le cerveau du patient qui va pénétrer dans les cellules malades du cerveau et réparer ces cellules en ajoutant une version normale du gène en question : c’est ce qu’on appelle la thérapie génique in vivo.

 

Les vecteurs de thérapie génique

Ce sont des virus. On n’a toujours pas trouvé mieux pour le moment. On utilise leur capacité à « infecter » (pénétrer) des cellules avec du matériel génétique. Mais on remplace le matériel génétique du virus par le gène de la maladie à traiter. Ces virus ne peuvent ainsi pas se multiplier et se propager. Ils sont dits « non-infectieux ». Il existe deux principaux types de vecteurs viraux de thérapie génique utilisés aujourd’hui. Les vecteurs lentiviraux, utilisés pour la thérapie génique des cellules souches hématopoïétiques, qui permettent de mettre le gène thérapeutique dans les chromosomes, au milieu des autres gènes. Les vecteurs AAV qui permettent de mettre le gène thérapeutique sous la forme d’un anneau d’ADN (comme c’est le cas du matériel génétique des bactéries) dans le noyau des cellules. Dans le premier cas, le gène thérapeutique est transmis à toutes les cellules filles des cellules corrigées, si elles se divisent, et à toutes les cellules qui en dérivent. Dans le second cas, le gène thérapeutique n’est transmis qu’à 50% des cellules filles, et si les cellules corrigées se divisent beaucoup, le gène thérapeutique finit par être perdu

 

L’application aux leucodystrophies

La thérapie génique des cellules souches hématopoïétiques est limitée à trois leucodystrophies seulement : l’adrénoleucodystrophie (ALD), la leucodystrophie métachromatique (MLD) et peut-être la leucodystrophie de Krabbe. Après greffe de cellules souches hématopoïétiques et reconstitution de la moelle osseuse, une sous-population de cellules spécialisées va se diriger vers le cerveau et s’y transformer en cellules appelées cellules microgliales. Dans le cas de la leucodystrophie métachromatique et la leucodystrophie de Krabbe, les cellules microgliales vont produire l’enzyme lysosomale normale (ARSA dans la leucodystrophie métachromatique et GALC dans la leucodystrophie de Krabbe). L’enzyme produite peut être recaptée par d’autres cellules non corrigées, les oligodendrocytes en particulier. L’adrénoleucodystrophie n’est pas due au déficit d’une enzyme, mais d’une protéine qui reste dans les cellules et participe à la dégradation des acides gras à très longue chaîne. Dans l’adrénoleucodystrophie, la greffe de cellules souches hématopoïétiques avec un donneur ou la thérapie génique de cellules souches hématopoïétiques ne répare que les cellules microgliales du cerveau, pas les oligodendrocytes. Ceci est cependant suffisant pour arrêter le processus de démyélinisation cérébrale.

 

Pour toutes les autres leucodystrophies, il faut mettre le gène thérapeutique directement dans les cellules du cerveau : oligodendrocytes, astrocytes ou les deux. Il faut donc un vecteur de thérapie génique qui soit capable de pénétrer dans ces cellules, que le vecteur soit injecté directement dans le cerveau ou par voie intraveineuse.  Pour certaines formes de leucodystrophie (maladie de Pelizaeus-Merzbacher due à des duplications du gène PLP, maladie d’Alexander due à des mutations du gène GFAP qui confèrent aux cellules malades une nouvelle fonction), il faut non pas mettre une copie du gène normal mais introduire du matériel génétique (dérivé d’un ARN le plus souvent) qui puisse diminuer l’expression gène muté.

 

Le choix des vecteurs et le mode d’administration

Le choix des vecteurs utilisés pour porter le gène médicament dépend du type de cellule que l’on veut corriger et donc du type de leucodystrophie. Dans le cas de la thérapie génique des cellules souches de moelle osseuse, on n’a pas d’autre choix que d’utiliser un lentivirus. Mais celui-ci met le gène thérapeutique n’importe où dans les chromosomes, n’importe où dans d’autres gènes. Il existe donc un risque de perturber le cycle normal de croissance des cellules de la moelle osseuse et d’induire avec d’autres facteurs surajoutés une leucémie. Aucune complication de ce genre n’a cependant été observée jusqu’ici chez plus de 30 patients traités. Le vecteur doit être capable de transporter un gène thérapeutique de grande taille, si le gène de la maladie est grand. C’est le cas des lentivirus, mais pas des vecteurs AAV. Quand on l’injecte par voie intraveineuse, le vecteur de thérapie génique doit pouvoir passer la barrière hémato-encéphalique pour arriver dans le cerveau. C’est le cas de certains types d’AAV, pas de tous les AAV, et les lentivirus ne passent pas ou très mal la barrière hémato-encéphalique.  Le vecteur peut être injecté directement dans le cerveau ou même dans le liquide céphalorachidien (comme pour une ponction lombaire). Mais la diffusion des vecteurs à partir des sites d’injection/de pénétration dans le tissus cérébral est faible ce qui nécessite de faire des injections intra-cérébrales multiples. Ceci augmente le risque de provoquer un hématome intracérébral. Pour les injections intraveineuse et intrathécale (dans le liquide céphalorachidien), il faut déterminer la quantité de virus à injecter, vérifier que le virus n’est pas toxique pour les autres organes, car on est obligé d’injecter de très grande quantité de virus.

La barrière hémato-encéphalique 

Parce qu’il est si important au fonctionnement du corps dans son ensemble, le cerveau est bien protégé. Il baigne dans un liquide et est encapsulé dans le crane. Le contact entre le sang et les cellules est étroit dans tous les organes. Mais le cerveau est une exception. Une barrière existe qui contrôle les entrées et les sorties tel un poste de douane. C’est la barrière hémato-encéphalique, constituée des cellules des vaisseaux cérébraux, d’astrocytes et de cellules spécialisées appelées péricytes. Et bien qu’elle soit là pour protéger le cerveau, cette barrière limite également l’accès des traitements élaborés par les médecins.

Dans le cas de la thérapie génique intraveineuse appliquée aux leucodystrophies, le passage de la barrière hémato-encéphalique représente un challenge majeur. Les chercheurs travaillent pour modifier l’enveloppe des virus afin de leur permettre de passer cette barrière hémato-encéphalique.

 

Les résultats des essais cliniques de la thérapie génique appliquée aux leucodystrophies

Au total, 42 enfants (21 ALD, 20 MLD, 13  leucodystrophies de Canavan) ont participé à des essais cliniques de thérapie génique.

  • Dans l’adrénoleucodystrophie (ALD)

Les premiers essais de thérapie génique contre l’adrénoleucodystrophie, financés fortement par ELA, ont été réalisés par l’équipe du Pr. Aubourg chez quatre patients atteints d’adrénoleucodystrophie avec atteinte cérébrale pour lesquels un donneur compatible n’était pas disponible. Ils ont montré que la thérapie était faisable et bien tolérée. En effet, pour la première fois au monde, des cellules souches hématopoïétiques prélevées chez des patients atteints d’adrénoleucodystrophie cérébrale ont été modifiées ex-vivo pour corriger le défaut génétique à l’origine de la maladie, avant d’être réinjectées aux patients. Cette approche innovante de thérapie génique a permis d’arrêter la progression de la maladie 14 à 16 mois après l’injection chez 3 des 4 patients traités avec des résultats semblables en terme d’efficacité à la greffe de moelle osseuse de cellules souches hématopoïétiques.

Ce traitement par thérapie génique est actuellement à l’essai (phase II/III) chez 17 autres patients et va être étendu encore à d’autres enfants. Comme pour la greffe de cellules souches hématopoïétiques avec un donneur, il ne peut être proposé qu’à des patients atteints d’adrénoleucodystrophie ne présentant pas de symptômes avancés de la forme cérébrale de la maladie et lorsqu’aucun frère ou sœur n’est compatible pour permettre une greffe de moelle.

  • Dans la leucodystrophie métachromatique (MLD)

Des essais cliniques de thérapie génique ont été conduits par l’équipe du Dr. Biffi en Italie sur 20 patients atteints de leucodystrophie métachromatique. Ils ont permis de montrer que le traitement était bien toléré par les patients. Les premiers résultats montrent aussi qu’un bénéfice clinique est possible chez les patients traités au stade pré-symptomatique, plusieurs mois avant que n’apparaissent les premiers symptômes moteurs. Il n’est pas clair qu’une efficacité soit observée chez des patients ayant déjà des symptômes, comme après une greffe de cellules souches hématopoïétiques. C’est probablement parce que la maladie évolue trop vite et qu’il faut au moins 12 mois avant qu’un nombre suffisant de cellules microgliales corrigées soit obtenu pour avoir un effet clinique.

  • Dans la leucodystrophie de Canavan

Aucun bénéfice thérapeutique clair n’a été obtenu. Il faut dire cependant que cet essai, ancien, a été réalisé avec un type de vecteur AAV peu performant qui n’est plus utilisé et que les patients traités avaient une forme très avancée de leur maladie

 

Conclusions

Avec plus de vingt-cinq ans de recul, les résultats indiquent un bénéfice de la greffe de moelle chez les patients atteints d’adrénoleucodystrophie, chez les enfants atteints de forme tardive de leucodystrophie métachromatique (formes dites « juvéniles ») et la leucodystrophie de Krabbe quand la greffe est faite à la naissance pour les formes précoces ou dans les formes d’apparition tardives de la maladie. Dans tous les cas, les résultats indiquent bien que la greffe n’a aucun effet chez les enfants présentant des symptômes évidents de la maladie. Elle ne marche qu’au tout début de la maladie, en pratique essentiellement quand les patients n’ont pas encore de symptômes évidents.

 

Perspectives

Les essais de thérapie génique réalisés chez des patients atteints d’adrénoleucodystrophie et de leucodystrophie métachromatique sont réellement porteurs d’espoir. Mais là encore ces traitements ne concernent que des enfants traités au tout début de leur maladie ou mieux sans symptômes. Un essai de thérapie génique, financé par ELA, et reposant sur l’injection intracérébrale de vecteur AAV est en cours dans la leucodystrophie métachromatique (Pr. Aubourg). Pour la leucodystrophie de Krabbe, les études en sont encore au stade préclinique, chez la souris, le chien ou le singe.  Pour toutes les autres leucodystrophies, une stratégie spécifique de thérapie génique devra être développée. Toutes les leucodystrophies ne seront pas traitables par thérapie génique.

 

Les premiers pas vers la thérapie génique dans le traitement des leucodystrophies ont pu être mis en œuvre en grande partie grâce aux dons faits à ELA pour soutenir la recherche contre les leucodystrophies.